مدخل الى علم البيوانفورماتيك

[م .نبيل زبن]

مصادر الدنا Sources of DNA

1- الدنا الكرموسومى


الكرموسوم هو المصدر الاساسى للدنا والمعلومات الوارثية .. فعندما نحتاج الى دارسة جين معين ولدى بعض المعلومات حول تتابع الجين وموضعه يمكنك استخلاص الدنا من خلال الخلية التى تريدها عن طريق انزيمات القطع لتعزل الجين الدى تريده .

ولكن طبعاً هدا بعد التخطيط الجيد لما تريد عمله ومعرفة مثلاً الانزيمات التى ستسخدمها ومكان قطعها وعدد مرات القطع وعدد القطع الناتجة وايضاً حجم الجينوم كله .. الخ

ويمكن استخدام الكرموسوم ككل فقط فى الخلايا الأولية النواة فقط .
ولكن هناك مشكلة بسيطة عند العمل مع الخلايا حقيقة النواة لانها تحتوى على مناطق لا يمكن ترجمتها الى بروتين تسمى دخلون Intron غير معلوم وظيفتها بالضبط ولكن يرجح انها تعمل كمنظم وللتحكم فى
تتابع الدنا .

يتكون تتابع الدنا الكرموسوم فى حقيقات النواة من تتابعين هما :
1- خرجون او الإكسوناتExon :
وهو الجزء من التتابع الدى يتم نسخه الى شريط الرنا الرسول ليتم ترجمته الى بروتين وهو يمثل الجزء الصغير من الكرموسوم وتمثل حوالى 5%
2- دخلون او الإنترونات Intron:
وهو تتابع الدنا الدى يتخلل خرجون او الإكسوناتExon .والدخلون او الإنترونات Intron تكون الجزء الاكبر من الكرموسوم ويمثل حوالى 95% .ولكن برغم دلك لا يتم نسخه الى شريط الرنا الرسول ليتم ترجمته الى بروتين .

لدلك ينبغى التخلص من دلك التتابع الخاص بالدخلون حتى يمكن الحصول على الجين ويتم دلك بطريقتين :
اما استخلاص الرنا الرسول الدى يكون منسوخ من تتابع الخرجون فى الجين (وهدا ما سناقشه فيما بعد ).
او عن طريق ازالة الدخلون من الجين عن طريق انزيم السبيلكيز Splicase ..
وهو الدى يحول شريط الدنا الغير ناضج او بالغ Immature( اى يحتوى على خرجون ودخلون معا ) الى شريط الدنا الناضج Mature ( اى يحتوى على خرجون فقط ) .
وبدلك يمكن اجراء عملية عزل الجين من حقيقات النواة بعدما تم التخلص من الدخلون

[م .نبيل زبن]

2- الدنا المكمل Complementary DNA


الطبيعى فى عملية الوارثة كما علمنا مسبقاً ان الدنا يتم نسخه الى شريط الرنا الرسول ثم يتم ترجمته بعد دلك الى البروتين .
ولكن هنا سنعكس الطريقة .. اى اننا سنقوم بالحصول على الدنا من مصدرين :
1- من شريط الرنا الرسول .. فى عملية تسمى النسخ العكسى Reverse Transcription
2 - أو من البروتين .... فى عملية تسمى الترجمة العكسية Reverse Translation
والشريط المتكون من هده العملية يسمى باسم الدنا المكمل Complementary DNA ويكتب اختصاراً هكدا cDNA




اولاً النسخ العكسى من شريط الرنا Generating cDNA from mRNA :


اى يتم نسخ شريط الرنا باستخدام انزيم معين الذى يقوم بعمل نسخة من الشريط مع استبدال قواعد اليوراسيل الموجودة فى الرنا بما يقابلها فى شريط الدنا .

ولكن للاسف وجد العلماء ان انزيم بلمرة الدنا الدى يقوم بنسخ شريط الدنا الى شريط الرنا غير عكسى .
اى انه لا يستطيع ان يسير بالعكس فيقوم بنسخ الرنا الى الدنا .
ولكن وجد بعض العلماء ان الفيروسات انها بمجرد دخولها الخلية تقوم بتحويل محتواها الوارثى المكون من شريط الرنا فقط الى الدنا ودلك باستخدام انزيم يسمى النسخ العكسى Reverse Transcriptase. ولذلك تم استخلاص هدا الانزيم من الفيروسات .


ثانياً : الترجمة العكسية للبروتين Reverse Translation

يمكن عن طريق استخلاص البروتين التعرف على الدنا . ودلك عن طريق تحليل سلاسل الاحماض الامنية المكونة للبروتين ومعرفة تتابع شريط الرنا الرسول الدى عن طريقه تم ترتيب الاحماض الامنية .
وبعد دلك يمكن تحوبل الرنا الى دنا بعد دلك .ويسمى دلك الشريط المتكون باسم الدنا المكمل Complementary DNA


3- المكتبة الجينية او المكتبات الوراثية - genomic libraries



بداية الجينوم هو مجموع المحتوى الوارثى كله للخلية الدى يتكون العديد من الجينات .
فالمكتبة الجينية عبارة عن توليفة او تجميعة من مستعمرات بكترتية تحتوى كل مستعمرة منها على جين معين من الجينوم الكلى للكائن نظريا ً .

بمعنى اخر انه يتم تقطيع الجينوم كله للكائن بواسطة الانزيمات . ثم يتم احد القطعة الناتجة وتهجينها فى البلازميد ليتم نقلها بعد دلك البكترتيا لتنمو وتكون نسخ عديدة من الجينات .

ويوجد نوعين من المكتبات الوارثية
1- المكتبة الجينية الناتجة من شريط الدنا الوارثى DNA
2- المكتبة الجينية لمكمل الدنا cDNA الناتجة من الترجمة العكسية للبروتين Reverse Translation

فى المكتبة الجينية نظرياً كل مستعمرة تحصل على جين معين من الجينوم كله تمثل كتاب فى مكتبة تحمل العديد من الكتب مثله التى تكون فى النهاية الجينوم كله


4- البى سى ار PCR


وهو اختصار الاحرف الاولى لـــ: Polymerase Chain Reaction
وهى تقنية حديثة فى مجال الهندسة الوارثية وتقوم فكرة عملها تكوين الدنا بطريقة صناعية ..
حيث يتم تصميم قطعة معينة من الدنا تسمى بالبادئ وهى عبارة عن تسلسل معين من القواعد يقابل المنطقة التى يبدأ عندها تتابع الجين فى شريط الدنا .
ويتم وضع دلك البادئPrimer مع العديد من القواعد الكيمائية الحرة التى تكون شريط الدنا فى محلول معين مع وجود انزيم التاج Taq polymerase الدى يتحمل الحرارة العالية والدى تم عزله من بكتريا تنمو فى اليانبيع الحارة بكاليفورنيا

[م .نبيل زبن]

ويتم تكبير الجين وعمل نسخ منه كثيرة بواسطة البى سى ار PCR عن طريق اربع خطوات :


1- فصل شريطى الدنا المزدوج الى شريطين منفصلين عن بعض عند درجة حرارة 95 درجة لمدة خمس دقائق .

2- التحام البادئ primer annealing بشريط الدنا عند خفض درجة الحرارة الى 60 درجة

3- استطالة البادئ primer extension عند درجة الحرارة الى 60 حتى نسمح لتمدد البادئ واستطالته عن طريق وضع القواعد المناسبة على شريط الدنا ليتكون شريط الدنا المزدوج مرة اخرى .
ولكن قد يتسأل البعض ولمادا لا يعد الاتحاد مرة اخرى بين الشريطين ؟؟
ولكن نادرا ما يحدث هذا لان البادئ يمنعهم بشكل جزئيى من الاتحاد .

4- نقوم بفصل شريط الدنا المزدوج مرة اخرى عند درجة الحرارة 95 درجة مرة اخرى .
وبتكرار تلك العملية سريعاً حتى نحصل على نسخ عديدة من الجينات التى نريدها وتتكرر هده العملية 36 مرة خلال 70 دقيقة .
ويكون الناتج كله من نهايات تامة او حادة او بشكل رأسي مستقيمblunt .






الشكل التالى عملية تكبير الجين من خلال جهاز البى سى ار وهو يوضح اربع دورات من التجربة :

[م .نبيل زبن]

النواقل Vectors

النواقل او الحامل ما هى وسيلة لحفظ الجين ويتم ادخال الجين الى النواقل لعدة أسباب :
- الناقل يحمى الجين من التدمير بواسطة الانزيمات الداخلية للخلية .
- الناقل يقوم بعمل نسخ كثيرة من الجين وتسمى هده العملية بالتكبير Amplification .
- جينات الناقل غالباً تحتوى على :
ا- جينات واقية من المضادات الحيوية لتحمى الخلية العائل من تأثير المضادات عليها
مثل جينات المقاومة للمضادات الحيوية امبيسيلين أو التترسيكيلين Resistance or tetracycline Ampicillin ويرمز لهما اختصارا باللغة الانجلزية كالتالى ampr اى مقاوم للامبيسيلين والمثل tetr

ب- منطقة جينية بها العديد من مناطق التعرف للعديد من انزيمات القطع حتى يمكن القطع واللصق للجينات بسهولة ويطلق عليها ( بولى لينكر ) Polylinker .

ج- منشأ للتكرار ليتضاعف تلقائيا

انواع النواقل :
1- البلازميد
2- الفاج
3- الكوسميد

[م .نبيل زبن]

البلازميد :

يعتبر البلازميد عنصر اضافى للجينات يمكن للبكتريا العيش بدونه . ويوجد فى اغلب انواع البكتريا وليس كلها . وهو ليس ضرورى للبكتريا ولكنه يضيف مزيد من الصفات الجيدة التى تمكن البكتريا من التأقلم مع الظروف البيئية المختلفة والاستمرار فى العيش خلالها.



البلازميد يمكن ان يتواجد بنسخ كثيرة داخل الخلية الواحدة . لدلك يمكن ان تضمن وجود ولو نسخة واحدة من الجين فى كل خلية جديدة ناشئة عن طريق الانقسام الخلوى .

و البلازميد عبارة عن قطعة من الحمض النووي موجود في البكتيريا خاصة في الاي كولي(E.Coli) و بعض أنوع الخميرة ( Yeast) .و لدية القدرة على التكاثر الذاتي و بمعزل من بقية الكروموسومات الموجودة في الخلية.كما أن هناك بلازميدات تستطيع التكاثر داخل البكتيريا و الخميرة في آن واحد.

و بالإضافة إلى وحدة التكاثر الذاتي الموجد على البلازميد هناك الكثير من الجينات التي قد تكون على البلازميد و هي مفيدة للعلماء في عملية نسخ الجينات و القطع النووية فمثلا فد يوجد على البلازميد جين خاص يكافح المضادات الحيوية كالمبيسيلين و التترسيكلين .
و هذه الجينات الحامية من المضادات الحيوية تساعد في التعرف و عزل البكتيريا التي تحتوي على البلازميد الذي عليه الجين الذي كنا ننوي استنساخه (كما عرفنا سابقاً)و يعتقد نظريا أن الفيروسات المنتشرة في الأصل كانت بلازميدات حيث أنها اكتسبت غلاف بروتيني خارجي و أصبحت فيروساً.

[م .نبيل زبن]

الناقلات الفيروسية ( Viral Vectors) :


إن اشهر هذه الأنواع هي الفيروسات البكتيرية المعروفة بالفاج ( Phage). والمقصود بها الفيروسات التى تخترق الخلية وتحقن فيها المادة الوراثية الفيروسية لتسطير على الخلية البكترية (كما هو واضح بالصورة حيث يقوم اثنان من الفاج باختراق الجدار الخلوى للبكتريا وحقن المادة الوارثية فيها )





و الفاج تقريباً عبارة عن قطعة من الدي ان أي DNA مغطاة بغلاف بروتيني.
ومن اشهر أنواع الفيج ما يسمى بفيج لمدا (lambda phage) و هو فيروس موجود في الاي كولي E. coli. وهذا النوع من الناقلات تستطيع أن تحمل قطعة من الدي إن أي حتى غاية 40 كيلوبيز.و لقد حوّرت هذه الفيروسات لكي تستطيع حمل كمية اكبر من الدي إن أي.

[م .نبيل زبن]

الكوسميد ( Cosmids )


الكوسميد هو عبارة عن هجين من البلازميدات والفاج .
فالكوزميد ( Cosmids ) عبارة عن تهجين جزء(قطعة من الدي ان تسمى اللاصقة cohesive sequence و تعرف مختصرة بالكوز Cos sequence) من فيج ليمبدا(Phage ) مع بلازميد (Plasmid ) و الذي يستطيع نقل حتى 40 كيلوبيز (40kb ) و الباك الفيروسي المسمى بكروموسوم بي 1 الصناعي (PAC P1-derived Artificial Chromosomes / ) عبارة عن تحوير للفيج بي 1 (P1 Bacteriophage ) و إضافته إلى البلازميد..




الشكل التالى يوضح تركيب الكوسميد ولصقه بالجين وتحميله على الفاج :

[م .نبيل زبن]

الكشف عن الدنا المهجن

قبل ان نكشف عن نجاح عملية الكلونة ونتأكد من دخول الجين المطلوب فى البلازميد واكثاره ،، لابد ان نعف اولاً انه هناك عدة احتمالات ل الجين بالبلازميد .




احتمالات الجين بالبلازميد :


يتوقع الكثير ان عملية الكلونة بغاية السهولة بحيث انه تنجح لاول مرة عند اجراء التجربة ..
ولكن ما لايعلمه البعض انه توجد ثلاثة احتمالات حتى نتأكد من نجاح عملية الجين بالبلازميد قبل اكمال بقية خطوات التجربة :


1- ان يلتف البلازميد ويلتحم مع نفسه وبالتالى لا يدخل معه الجين .. وبذلك تضيع التجربة هباء لانه لم يتحقق المطلوب منها وهو ان يدخل الجين مع البلازميد الى الخلية .

2- ان يلتف الجين ويلتحم مع نفسه ولا يندمج مع البلازميد .. وقد ينتقل الى الخلية ولكنه يصبح بلا تأثير لانه غير ثابت وربما يتحلل بعد فترة .

3- ان يلتحم الجين مع البلازميد .. وهدا هو المطلوب وبذلك تنجح العملية .

ويسعى العلماء الى زيادة نجاح التجربة والتقليل من فشلها بمنع حدوث عملية التفاف الجين او البلازميد على نفسه . ويتم دلك بطرق عديدة من أهمها :

استغلال صفات البلازميد نفسه . حيث ان البلازميد يحتوى على جينات تجعله مقاوم للمضادات الحيوية مثل الأمبلسين Ampicillin . فعندما نحقن البلازميد فى بكتريا حساسة للامبلسين (اى تموت بسبه ولا تتسطيع مقاومته) فانها تكتسب مناعة ضد دلك المضاد الحيوى وتستمر فى النمو .

[م .نبيل زبن]

وبالتالى للتأكد من دخول البلازميد الى الخلية فاننا ننمى الخلية الحساسة للامبلسين فى وسط غدائى يحتوى على دلك المضاد .. فان ماتت الخلية دل دلك على عدم دخول البلازميد للخلية .. اما ادا نمت الخلية دل دلك على نجاح دخول البلازميد للخلية ويكون قد تأكدنا من دخول البلازميد للخلية .
ويتم الكشف عن الجين بعد دلك عن طريق التقاط مستعمرة منفصلة من الطبق وتنميتها فى انبوبة ويتم استخلاص الدنا من البكتريا عن طريق جهاز الطرد المركزى ثم نحصل على البلازميد فقط ويعامل بنفس انزيم القطع المستخدم قبل دلك ثم يتم جريان او سريان العينة على جهاز الفصل الكهربى وتحديد عدد البندات( الاشرطة التى تظهر لتدل على وجود قطع الدنا ) .
فادا وحود اثنين من الباند دل دلك ع لى نجاخ التحربة حيث يظهر واحد للبلازميد واخر الجين . اما ادا ظهر باند واحد دل على فشل التجربة .




الشكل التالى يوضح خلية بكترية مقاومة للامبلسين نتيجة وجود البلازميد ، لدلك بعد فترة تترك حولها منطقة رائقة نتيجة تدمير الامبلسين بواسطة الخلية .




طريقة الانتقاء اللونى للكشف عن الدنا المهجن :


وهناك طريقة اخرى شائعة تستخدم للكشف عن الدنا المهجن فى الخلية عن طريق ادخال الجين المطلوب فى وسط جين اخر موجود على اللازميد يعطى لون معين عند تنميته على مواد كيمائية معينة فى بيئة الاجار .

مثل جين انزيم بيتاجالاكتو سيديز B-glactosidase الذى يعطى لمستعمرة البكتريا اللون الازرق فى بيئة معينة ،، ولكن عند تحطيم هذا الجين وافساد عمله فانه يعطى للمستعمرة لوناً ابيض يسهل تميزه .

لذلك نقوم بوضع الجين المراد ادخاله فى البلازميد فى وسط جين انزيم بيتاجالاكتو سيديز B-glactosidase حتى يبطل عمله ،، فيعطى للمستعمرة التى بها الجين الخاص بنا اللون الابيض فيسهل التقاطه لنا من المستعمرات الاخرى التى لونها ازرق .

[م .نبيل زبن]

تكنولوجيا المعلومات الحيوية وعصر البروتيوم Proteomics

بعد ما انتهينا من شرح الجزء السابق من الدورة اعتقد انه اتضحت لنا الصورة التى تقوم عليها تكنولوجيا المعلومات الحيوية ( البيوانفورماتك ) ..

فمثلاً الكثير والعديد من الامراض التى قد يعرفها الانسان جيدا ويكون سببها نقص نوع من أنواع البروتين
مثل مرض السكر الشهير وكدلك بعض امراض التقزم ( قصر الطول ) وايضا مرض نزف الدم الهيميوفليا ، كلها نتجت من نقص الانسولين وهرمون النمو وعامل تجلط الدم .

كل هده الامراض يمكن معالجتها بالحقن بجرعات كافية من البروتين. هده البروتينات يمكن عزلها من مواد طبيعية مثل الانسولين من الخنازير ولكنها بالطبع باهظة التكاليف . ولو توفرت تلك المواد لامكن توفير كثير من العلاج وفى نفس الوقت التكاليف .

لدلك يسعى العلماء والباحثين الى معرفة تراكيب تلك البروتينات والعمل على توفيرها باستخدم تقنيات البيوتكنولوجيا الحديثة ، ودلك عن طريق استخلاص البروتين وتنقيته ثم يتم بعد دلك الكشف عن تتابع الاحماض الامنية الخاصة به وعن طريق الكمبيوتر وقواعد البيانات نستطيع ان نوجد كل المعلومات المتوفرة عنه ومعرفة تتابع الشريط الوارثى ومعرفة الجين المسئول عن ظهوره ونسخه وتكبيره ودارسته .. وفى نفس الوقت وباستخدام برامج الرسوميات المعقدة يمكن الكشف عن الشكل الفراغى للبروتين ومعرفة تراكيب البروتين المختلفة ودارستها جيداَ .

لاشك تماما ان البروتينات تلعب دوراً حيوياً فى الكشف عن المزيد من العقاقير والادوية وايضا طرق عديدة للقضاء على الامراض ولكن كل هدا يقف فى تحدى مع الزمن ومدى تقنية المعلومات وسرعة الوصول اليها وايضا الربط بينها للكشف عن مزيد ومزيد من الاسرار والخبايا والتى بالطبع الكمبيوتر ومبرمجيه يمثلون ركن اساسى فى هدا الموضوع .العودة للأعلى